PCR技术在基层疾控中心实验室的应用案例
四川华锐净化 2019-03-31 13:30:39 阅读
【摘要】目的 为了具备病毒核酸检测能力，对流感病毒和手足口病毒进行鉴定和分型。方法 1申请资金建立PCR实验室；2 RT-PCR技术和Real-time PCR技术在流感和手足口病毒检测中的应用；结果 1 2009年宁夏吴忠市PCR实验室建成投入使用；2流感样常规监测、暴发疫情快速确诊流感病毒类型，荧光定量PCR技术和双重荧光定量PCR技术对手足口病样核酸鉴定和分型。结论 吴忠市PCR实验室的建立，RT-PCR技术和Real-time PCR技术在基层疾控中心实验室的运用，吴忠市疾控中心实验室首次具备核酸检测能力，提高了基层实验室的技术能力，为流行病疫情的流行水平和变化趋势提供科学有效的数据，为我市的疾病防控工作能力提供了技术支撑，也为分子生物学在基层实验室开展研究奠定基础。建立基层PCR实验室不尽是基层实验室能力建设的一个巨大飞跃，更是在现代疾病预防控制事业中起到了巨大的作用。
【关键词】PCR实验室 基层 建立 现状 应用
PCR技术是一种快速DNA片段扩增技术，具有高灵敏性、高特异性、简便、快速以及对标本质量要求较低的特点，已经成为一种对标本中的特定DNA片段进行研究和检测鉴定的重要方法，被广泛用于病毒学诊断，尤其是病毒性疾病的早期诊断[1]。Real-time PCR是新研制出的一种核酸定量技术，该技术是在RT-PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，在PCR反应系统中引入了荧光标记探针具有高灵敏性、高特异性和高精确性的特点。PCR 技术在基层疾控中心的开展，提高了基层实验室的技术能力，为流行病疫情的流行水平和变化趋势提供科学有效的数据，为我市的疾病防控工作能力提供了技术支撑，也为分子生物学在基层实验室开展研究奠定基础，在现代疾病预防控制事业中起到了巨大的作用。
1 方法
1.1 吴忠市疾控中心申请建立PCR实验室。
吴忠市PCR实验室的建立有其历史必要性。2009甲型H1N1流感爆发引发的相关疾病死亡，给人类生命财产和社会经济发展带来灾难性的打击。在当年的5月，还没有特效治疗的药物，尚无有效的预防疫苗，相关的疫苗研发正在进行之中[2]。甲型H1N1流感疫情的蔓延和流行趋势，引起全球人民的高度恐慌。我国密切关注甲型H1N1流感的发生和传播，各级疾控中心加强监测和检测，及时应对疫情的发生。面对可能大规模爆发的流感疫情，我们的实验室检测工作已经无法解决对疫情病毒的确诊工作，无法满足这种空前危机的局势,扩大流感检测实验室，应对疫情危机已经是迫在眉睫的问题。实验室检测是确诊流感病例的重要依据，为进一步加强疫情监测，严防疫情扩散，需逐步将现有流感监测网络实验室扩大到所有地市级疾病预防控制中心，因此建立基层PCR实验室是这种历史时期的必然趋势。
PCR实验室是分子生物实验室，因其技术参数条件高，造价昂贵，开展工作耗资巨大，因此很难在基层实验室建立。2009年，在特定的历史时期，宁夏吴忠市疾控中心积极向上级部门和地方政府汇报建立PCR实验室的必要性，并申请项目资金，申请审批在吴忠市疾控中心建立PCR实验室。
1.2 RT-PCR技术和Real-time PCR技术在基层疾控中心实验室的运用。
宁夏吴忠市PCR实验室按照标准配置了普通PCR扩增仪、定量Real-time实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、倒置显微镜、A2型生物安全柜、B2型生物安全柜、超净工作台、低温冷冻离心机、培养箱、高压锅、-70摄氏度低温冷冻冰箱、纯水仪等仪器设备30余件。
在PCR实验室建设同时，吴忠市疾控中心先后派出2名专业技术人员到宁夏自治区疾控中心病毒实验室进行了专项培训，通过考核，获得了上岗证书。
2009年11月22日，经过宁夏回族自治区疾控中心专家的现场流感样盲样的考核验收，达标后以RT-PCR技术开展流感核酸检测工作开始正式投入使用，标志着PCR技术首次在基层实验室的开展。
2 结果
2.1 在国家和地方政府的大力支持下，在单位领导的努力和各位专家的指导下，吴忠市PCR实验室于同年11月份建成。
宁夏吴忠市PCR实验室严格按照生物安全Ⅱ级的要求在市疾控中心进行设计和建设。 PCR技术基本原理就是将感样本的特异基因组核酸基因片段通过聚集、提取、扩增，分析其扩增产物来确定流感病毒的类型。完成一组PCR实验，通常应经过试剂配制、样品处理、核酸扩增及产物分析四个实验过程[3]。
宁夏吴忠市疾控中心的PCR实验室在环境结构上是组合形式的PCR实验室，是指完成PCR四个实验过程的实验和用房是相邻布置的，组成独立实验区域的形式。实验室设有PCR内部专用走廊。实验室间有试剂配制室、样品处理室、核酸扩增室及核酸扩增产物分析室组成。各室在入口处设置有缓冲间，以减少室内外空气交换。我中心的PCR实验室是通过独立的送排风系统，控制气流方向和压差，气流由清洁区流向污染区 。
2.2 目前，吴忠市PCR实验室运用RT-PCR技术和Real-time PCR技术承担来自哨点医院（吴忠市人民医院）的发热病人的流感样样本的常规检测，同时还担负着整个吴忠市辖区暴发集体发热疫情的现场快速检测及实验室确诊检测工作，确诊流感病毒类型及分型。运用Real-time PCR技术和双重Real-time PCR技术对本手足口病样核酸鉴定和分型。对流感样和手足口病样核酸检测，吴忠市PCR实验室检测的阳性样品，全部都及时送到宁夏回族自治区疾控中心病毒科实验室复核，结果一致，没有出现结果异常或者是不符合情况。国家流感中心在2009年10月和2010年10月，两次组织对国家流感网络络实验室分别进行为数10份的流感盲样标本分型考核，盲样考核样品由国家流感中心统一提供。吴忠市疾控中心流感网络实验室的考核盲样结果符合率均为100%，顺利通过，这是对工作人员尽快掌握RT-PCR技术和Real-time PCR技术的肯定。吴忠市PCR实验室自建成开展工作以来，无安全事故发生，没有检测结果错误情况，一切运转正常。
3 结论：
3.1 吴忠市PCR实验室运用RT-PCR技术和Real-time PCR技术检测包括甲型H1N1流感在内的各种流感病毒核酸，及时确诊流感病毒的类型及其亚型，为流感疫情的流行水平和变化趋势提供科学有效的数据，为提高我市的疾病防控工作能力提供了技术支撑。
3.2 在吴忠市PCR实验室运用荧光定量PCR技术和双重荧光定量PCR技术检测手足口病核酸分型，暴发疫情快速确诊肠道病毒类型，掌握EV71和CoxA16感染流行特征，为疫情的流行水平和变化趋势提供科学有效的数据，同时为临床诊断以及制定预防措施提供依据。
3.3 吴忠市PCR实验室，作为一个分子诊断实验室，能够为将来开展PCR技术支持的任何其它病毒核酸检测提供实验环境，在今后的发展中将会发挥其最大效应，也许在不久的将来，丙肝病毒、艾滋病毒、乙脑病毒、轮状病毒、流感病毒、麻疹病毒、腺病毒、EB病毒、风疹病毒等需要PCR技术支持病毒核酸检测都能够在吴忠市疾控中心这样的基层PCR实验室完成。PCR技术在吴忠市疾控中心实验室的运用，提高了实验室的技术能力，也为分子生物学在基层实验室开展研究奠定基础。。
宁夏吴忠市PCR实验室的建成启用，极大地提高了我市流感传染病和手足口病诊断的及时性和准确性，对有效预防控制流感病毒和手足口病传染病发挥重要的指导性作用。RT-PCR技术和Real-time PCR技术在基层疾控中心实验室的运用，吴忠市疾控中心实验室首次具备核酸检测能力，提高了基层实验室的技术能力，为流行病疫情的流行水平和变化趋势提供科学有效的数据，为我市的疾病防控工作能力提供了技术支撑，也为分子生物学在基层实验室开展研究奠定基础。建立基层PCR实验室不尽是基层实验室能力建设的一个巨大飞跃，更是在现代疾病预防控制事业中起到了巨大的作用。
【关键词】PCR实验室 基层 建立 现状 应用
PCR技术是一种快速DNA片段扩增技术，具有高灵敏性、高特异性、简便、快速以及对标本质量要求较低的特点，已经成为一种对标本中的特定DNA片段进行研究和检测鉴定的重要方法，被广泛用于病毒学诊断，尤其是病毒性疾病的早期诊断[1]。Real-time PCR是新研制出的一种核酸定量技术，该技术是在RT-PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，在PCR反应系统中引入了荧光标记探针具有高灵敏性、高特异性和高精确性的特点。PCR 技术在基层疾控中心的开展，提高了基层实验室的技术能力，为流行病疫情的流行水平和变化趋势提供科学有效的数据，为我市的疾病防控工作能力提供了技术支撑，也为分子生物学在基层实验室开展研究奠定基础，在现代疾病预防控制事业中起到了巨大的作用。
1 方法
1.1 吴忠市疾控中心申请建立PCR实验室。
吴忠市PCR实验室的建立有其历史必要性。2009甲型H1N1流感爆发引发的相关疾病死亡，给人类生命财产和社会经济发展带来灾难性的打击。在当年的5月，还没有特效治疗的药物，尚无有效的预防疫苗，相关的疫苗研发正在进行之中[2]。甲型H1N1流感疫情的蔓延和流行趋势，引起全球人民的高度恐慌。我国密切关注甲型H1N1流感的发生和传播，各级疾控中心加强监测和检测，及时应对疫情的发生。面对可能大规模爆发的流感疫情，我们的实验室检测工作已经无法解决对疫情病毒的确诊工作，无法满足这种空前危机的局势,扩大流感检测实验室，应对疫情危机已经是迫在眉睫的问题。实验室检测是确诊流感病例的重要依据，为进一步加强疫情监测，严防疫情扩散，需逐步将现有流感监测网络实验室扩大到所有地市级疾病预防控制中心，因此建立基层PCR实验室是这种历史时期的必然趋势。
PCR实验室是分子生物实验室，因其技术参数条件高，造价昂贵，开展工作耗资巨大，因此很难在基层实验室建立。2009年，在特定的历史时期，宁夏吴忠市疾控中心积极向上级部门和地方政府汇报建立PCR实验室的必要性，并申请项目资金，申请审批在吴忠市疾控中心建立PCR实验室。
1.2 RT-PCR技术和Real-time PCR技术在基层疾控中心实验室的运用。
宁夏吴忠市PCR实验室按照标准配置了普通PCR扩增仪、定量Real-time实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、倒置显微镜、A2型生物安全柜、B2型生物安全柜、超净工作台、低温冷冻离心机、培养箱、高压锅、-70摄氏度低温冷冻冰箱、纯水仪等仪器设备30余件。
在PCR实验室建设同时，吴忠市疾控中心先后派出2名专业技术人员到宁夏自治区疾控中心病毒实验室进行了专项培训，通过考核，获得了上岗证书。
2009年11月22日，经过宁夏回族自治区疾控中心专家的现场流感样盲样的考核验收，达标后以RT-PCR技术开展流感核酸检测工作开始正式投入使用，标志着PCR技术首次在基层实验室的开展。
2 结果
2.1 在国家和地方政府的大力支持下，在单位领导的努力和各位专家的指导下，吴忠市PCR实验室于同年11月份建成。
宁夏吴忠市PCR实验室严格按照生物安全Ⅱ级的要求在市疾控中心进行设计和建设。 PCR技术基本原理就是将感样本的特异基因组核酸基因片段通过聚集、提取、扩增，分析其扩增产物来确定流感病毒的类型。完成一组PCR实验，通常应经过试剂配制、样品处理、核酸扩增及产物分析四个实验过程[3]。
宁夏吴忠市疾控中心的PCR实验室在环境结构上是组合形式的PCR实验室，是指完成PCR四个实验过程的实验和用房是相邻布置的，组成独立实验区域的形式。实验室设有PCR内部专用走廊。实验室间有试剂配制室、样品处理室、核酸扩增室及核酸扩增产物分析室组成。各室在入口处设置有缓冲间，以减少室内外空气交换。我中心的PCR实验室是通过独立的送排风系统，控制气流方向和压差，气流由清洁区流向污染区 。
2.2 目前，吴忠市PCR实验室运用RT-PCR技术和Real-time PCR技术承担来自哨点医院（吴忠市人民医院）的发热病人的流感样样本的常规检测，同时还担负着整个吴忠市辖区暴发集体发热疫情的现场快速检测及实验室确诊检测工作，确诊流感病毒类型及分型。运用Real-time PCR技术和双重Real-time PCR技术对本手足口病样核酸鉴定和分型。对流感样和手足口病样核酸检测，吴忠市PCR实验室检测的阳性样品，全部都及时送到宁夏回族自治区疾控中心病毒科实验室复核，结果一致，没有出现结果异常或者是不符合情况。国家流感中心在2009年10月和2010年10月，两次组织对国家流感网络络实验室分别进行为数10份的流感盲样标本分型考核，盲样考核样品由国家流感中心统一提供。吴忠市疾控中心流感网络实验室的考核盲样结果符合率均为100%，顺利通过，这是对工作人员尽快掌握RT-PCR技术和Real-time PCR技术的肯定。吴忠市PCR实验室自建成开展工作以来，无安全事故发生，没有检测结果错误情况，一切运转正常。
3 结论：
3.1 吴忠市PCR实验室运用RT-PCR技术和Real-time PCR技术检测包括甲型H1N1流感在内的各种流感病毒核酸，及时确诊流感病毒的类型及其亚型，为流感疫情的流行水平和变化趋势提供科学有效的数据，为提高我市的疾病防控工作能力提供了技术支撑。
3.2 在吴忠市PCR实验室运用荧光定量PCR技术和双重荧光定量PCR技术检测手足口病核酸分型，暴发疫情快速确诊肠道病毒类型，掌握EV71和CoxA16感染流行特征，为疫情的流行水平和变化趋势提供科学有效的数据，同时为临床诊断以及制定预防措施提供依据。
3.3 吴忠市PCR实验室，作为一个分子诊断实验室，能够为将来开展PCR技术支持的任何其它病毒核酸检测提供实验环境，在今后的发展中将会发挥其最大效应，也许在不久的将来，丙肝病毒、艾滋病毒、乙脑病毒、轮状病毒、流感病毒、麻疹病毒、腺病毒、EB病毒、风疹病毒等需要PCR技术支持病毒核酸检测都能够在吴忠市疾控中心这样的基层PCR实验室完成。PCR技术在吴忠市疾控中心实验室的运用，提高了实验室的技术能力，也为分子生物学在基层实验室开展研究奠定基础。。
宁夏吴忠市PCR实验室的建成启用，极大地提高了我市流感传染病和手足口病诊断的及时性和准确性，对有效预防控制流感病毒和手足口病传染病发挥重要的指导性作用。RT-PCR技术和Real-time PCR技术在基层疾控中心实验室的运用，吴忠市疾控中心实验室首次具备核酸检测能力，提高了基层实验室的技术能力，为流行病疫情的流行水平和变化趋势提供科学有效的数据，为我市的疾病防控工作能力提供了技术支撑，也为分子生物学在基层实验室开展研究奠定基础。建立基层PCR实验室不尽是基层实验室能力建设的一个巨大飞跃，更是在现代疾病预防控制事业中起到了巨大的作用。
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